原代單核細(xì)胞分離技術(shù)

1、 取新鮮抗凝全血（EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝血均可）或者去纖維蛋白血液，用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。

2、 取一支無菌離心管，先加入試劑A，再加入試劑D，使兩者形成梯度界面（試劑A：試劑D的體積比為3：2，如稀釋后的血液樣本小于5ml，則先后加入3ml試劑A和2ml試劑D；如稀釋后的血液樣本大于5ml，試劑總量與稀釋后的血液樣本量相等），兩種試劑的分層一定要清晰。

3、 將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方，注意保持兩液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后將血液小心的平鋪于分離液上，因?yàn)閮烧叩拿芏炔町悾瑢⑿纬擅黠@的分層界面。如果樣品較多，加樣的時(shí)間較長(zhǎng)，在離心之前出現(xiàn)紅細(xì)胞成團(tuán)下沉屬正常現(xiàn)象）

4、 室溫，水平轉(zhuǎn)子500~800g，離心20~30min（血液的體積越大所需的離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，最佳的分離條件需自行摸索，離心轉(zhuǎn)速最大不超過1000g）。

5、 離心后將出現(xiàn)明顯的分層： 第一層為血漿層；第二層為白色單核細(xì)胞層；第三層為透明試劑D液層；第四層為半透明試劑A液層；第五層為紅細(xì)胞層（如圖示）。

6、 小心吸取第二層白色單核細(xì)胞層到另一無菌的15ml離心管中，加入10mL細(xì)胞洗滌液或PBS，顛倒混勻，250g，離心10min。

7、 棄上清，5mL的細(xì)胞清洗液或PBS重懸細(xì)胞，250g，離心10min。

8、 重復(fù)步驟7

9、 棄上清，細(xì)胞重懸備用。

10、 差異貼壁法純化細(xì)胞：用單核細(xì)胞培養(yǎng)基以106個(gè)/ml的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。

1) 2~4 h內(nèi)貼壁的為單核細(xì)胞。

2) 10~24 h內(nèi)貼壁的單個(gè)核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞 。

3) 不貼壁的為淋巴細(xì)胞。